Fakultetska 3, 72000 Zenica, Bosna i Hercegovina    |    tel. (+387 32) 444 420, 444 421     |    fax. (+387 32) 444 431    |    E-mail: rektorat@unze.ba
Univerzitet u Zenici
  Doktorske teze odbranjene na Univerzitetu u Zenici

Datum i mjesto odbrane:
10.01.2013. godine, Zenica
Kandidat:
prim. doc. dr. sci. med. Mersija Kasumović
Mentor:
prof.dr.sci. Đemo Subašić
Komisija za odbranu:
prof.dr. Sahib Muminagić (predsjednik komisije)
prof.dr.sci. Izet Eminović (član)

prof.dr.sci. Đemo Subašić (mentor)

Naslov teme:
Istraživanje korelacije ekspresije TIMP-1 i TIMP-1 gena i nekih specifičnih biomarkera kod pacijenata sa sistemskim eritemskim lupusom

Rezime
Sistemski eritemski lupus ( SEL ) je kompleksni autoimuni poremećaj multigenskog karaktera. Utvrđeno je da veliki broj gena ima izmjenjenu ekspresiju kod osoba oboljelih od ove bolesti a da je njihova uloga uglavnom u procesu apoptoze, popravka oštećenih DNA molekula, adheziji i određivanju receptora imunog sistema.Jedan od gena koji je često objekat istraživanja kod SEL je TIMP-1 gen (Tissue inhibitor matrix metalloproteinase 1 gen ).TIMP-1 gen kodira TIMP-1 protein a koji je u stvari prirodni inhibitor nekih matriks metaloproteinaza kao što su MMP-1 i MMP-9.

Dakle u organizmu je uravnotežen odnos matriks metaloproteinaza i njihovih inhibitora na bazi povratne sprege, čime se održava stanje autotolerancije i na neki način sprečava njeno narušavanje. Svaka izmjena u već određenoj ekspresiji navedenih gena dovodi do gubitka samotolerancije i indukcije autoimunosti.Uglavnom je već utvrđeno da je kod SEL pacijenata smanjen nivo ekspresije TIMP-1 gena što naravno ima logičnu posljedicu povećanja naivoa MMP-1 i MMP-9 proteinskih enzima.Osim ovih gena ustanovljena je izmjenjena ekspresija preko 1000 gena kod sistemskog eritemskog lupusa.

Osim aspekta koji se odnosi na matriks metaloproteinaze i njihove prirodne inhibitore, uočeno je da se smanjuje nivo bitnih komponenti komplementa kao što su C3 i C4 kao i broja T limfocita ( CD4 i CD8) koji su uključeni u procese reguliranja periferne tolerancije i na taj način preveniraju sintezu autoantitjela, kao ključnog početnog događaja u SEL etiopatologiji.

Svaka ozbiljna istraživanja molekularne osnove sistemskog eritemskog lupusa moraju uključivati genski aspekt, enzimatski aspekt i aspekt nivoa CD4 i CD8 T limfocita, NK ćelija i B limfocita a sve u svjetlu specifičnih biomarkera aktivnosti bolesti.

Dakle, osim dijagnostičkih SEL biomarkera (ANA, anti-Sm, anti-ds-DNA), postoje i biomarkeri aktivnosti kao što su nivo C3 i C4 komplement komponenti, anti-kardiolipinska antitjela i anti-Sm/RNPs antitjela.Kod SEL pacijenata može se raditi o aktivnoj i pasivnoj fazi bolesti, tz. overlap sindromu, kada se simptomatologija nekoliko sistemskih autoimunih oboljenja preklapa, antifosfolipidnom sindromu i nekim drugim kliničkim karakteristikama.

Također se ne smije zanemariti uloga citokina u SEL indukciji budući da je ekspresija TIMPs i MMPs gena regulisana od strane citokina IL-1 beta i TGF-ß.

Inače u kliničkom menadžmentu SEL pacijenata prati se nivo CD4+ i CD8+ T limfocita  sa ciljem praćenja aktivnosti bolesti. Neka istraživanja su pokazala povećan nivo dvostruko negativnih T lifocita ( CD4- CD8- ) ili DNT( double negative T-cells ) kod SEL pacijenata.Protočnom citometrijom se prati nivo DNT kod SEL pacijenata u mononuklearnim ćelijama periferne krvi kod kojih je uočen uvećan nivo DNT ćelija. Smatra se da ove ćelije ne igraju ulogu u SEL aktivnosti mada to nije sasvim pouzdano utvrđeno. Ipak istraživanja koja su proveli Sawada i sar. 1993 ukazala su da je nivo CD4+ i CD8+ T limfocita značajno uvećan u slučajevima aktivnog sistemskog lupusa a također je utvrđena pozitivna korelacija sa sedimentacijom eritrocita, nivoom anti-ds-DNA i IgG dok je negativna korelacija bila sa nivoom komplement komponenti. Svi ovi paramatri su bitni kada se prati intenzitet aktivnosti bolesti kod SEL pacijenata.

Dakle, protočnom citometrijom se definišu klinički limfocitni fenotipovi u uzorcima periferne krvi kod SEL pacijenata, površinski receptori NK ćelija  ( G2A i G2D) jer se može doći do značajnih podataka bitnih za patoetiologiju sistemskog eritemskog lupusa.

Na osnovu svih navedenih činjenica ovim  istraživanjima molekularne osnove SEL bio je obuhvaćen aspekt ekspresije TIMP-1 i MMP1- gena, nivo specifičnih biomarkera aktivnosti kao što su C3, C4, Anti-ds-DNA, anti-Sm, anti-Sm/RNPs, ACA-G, ACA-M, Beta-2-G, Beta-2-M te nivo ćelija imunoig sistema koji su zaduženi za održavanje autotolerancije a to su CD4 i CD8 T limfociti.

Tokom 2011 godine u KCU-Sarajevo na Institutu za kliničku imunologiju analizirani su uzorci seruma 300 pacijenata suspektnih na SEL i selektiranih od strane kliničara III Interne klinike. Diferencijalnom dijagnostikom određeno je 24 seruma sa karakterističnim SEL parametrima. Kasnije su većina tih pacijenata hospitalizirani i kroz analizu uzoraka njihovih seruma praćen je nivo navedenih biomarkera aktivnosti i nivoa ekspresije TIMP-1 i MMP-1 gena na nivou mRNA molekula sa jedne i nivoa CD4 i CD8 T limfocita sa druge strane.Analize su vršene sljedećim metodama:

- IFT( Imunofluorescentna tehnika )
- ELISA test
- Nefelometrija
- Protočna citometrija
- RT-PCR

Istraživanja su pokazala sljedeće:

- Visoke vrijednosti anti-Sm/RNPs uvjek su bile u korelaciji sa vrijednostima ACA-G i ACA-M, te da je ovaj biomarker bitniji u procesu dijagnostike, te da nije toliko pouzdan kada se radi o aktivnosti bolesti.
- Beta-2 G i Beta-2-M nisu se pokazali dobrim pokazateljima SEL aktivnosti jer se njihov nivo nije značajnije mijenjao bez obzira na variranje ostalih kliničkih i laboratorijskih parametara
- Nivoi C3 i C4 su redovno bili umanjeni kod velike većine pacijenata sa aktivnom fazom bolesti iz čega proizilazi da se radi a dobrim biomarkewrima SEL aktivnosti i efikasnosti terapije. Nivo C3 i C4 treba pratiti nekoliko sedmica a u slučajevima njihovog perzistentno niskog nivoa redovno je  rađena renalna biopsija i laborattorijska analiza bitnih komponenti komplementa.
- Utvrđena skala senzitivnosti i specifičnosti analiziranih SEL biomarkera aktivnosti imala je sljedeće vrijednosti:

Beta-2-G---------------13,0%
Beta-2-M--------------13,0%
Anti-Sm/RNPs--------29,10%
ACA-IgG--------------50,0%
ACA-IgM------------- 58,3%
C4 nivo----------------79,1%
C3 nivo----------------87,5%

- Povećane vrijednosti imunoglobulina bile su u koleraciji sa imunofenotipizacijskim parametrima a u većini slučajeva radilo se o povećanom nivou CD3 a reduciranom nivou CD3+/HLA-DR i ukupnom HLA-DR izraženim na limfocitima.

- Treba naglasiti da su analizirani nivoi CD4+CD25+ i CD4+CD25- za koje inače ne postoje referentne vrijednosti, tako da se nisu mogle dovesti u korelaciju sa ostalim parametrima ali ipak neophodno je utvrditi u daljim istraživanjima njihov nivo kod odgovarajućeg broja, specifično odabranih,  zdravih osoba kako bi se utvrdile referentne vrijednosti za ove parametre i to za populaciju ljudi koja živi u BiH.Inače svaka laboratorija u svijetu ustanovljava vlastite referalne vrijednosti ovih parametara, jer se naravno uzima u obzir individualno genetičko variranje.

Inače, u ovim istraživanjima je ustanovljena pozitivna korelacija između CD3( T-ly) te CD3+/HLA-DR i ukupnog HLA-DR.

Kod OS pacijenata osim antifosfolipidnog sindroma ustanovljene su i kliničke komplikacije kao što su infarkt miokarda, plućna tromboembolija, renalne komplikacije, pankreasne komplikacije te anemija.

Pokazalo se da je terapija bila efikasnija što se tiče normalizacije T limfocita u odnosu na B limfocite.

Također je ustanovljeno da pacijenti sa pretežnim simptomima  inflamacije zglobova, nemaju tako izražene imunofenotipske promjene kao SEL pacijenti sa overlap sindromom. Bilo je očigledno da je u takvim slučajevima bilo lakše pratiti aktivnost bolesti te efikasnost terapije preko parametara kao što su nivo imunoglobulina, C3, C4, CIC i antikardiolipnskih antitjela.Treba naglasiti i to da je nivo serumskih C3 i C4 karakterističan parametar u dijagnostici i praćenju lupusnog nefritisa jer se redovno radi o njihovim niskim nivoima u takvim slučajevima.

Ekspresija TIMP1 gena kretala se od 8,742 do 49,253.

Ekspresija MMP1 gena kretala se od  40,087 do 46,479.

Dakle, ekspresija MMP1 gena  bila je puno stabilnija u odnosu na TIMP1 i nije bilo ekstremno niskih vrijednosti u slučajevima sistemskog eritemskog lupusa.

Nije se mogla ustanoviti značajna korelacija u ekspresiji ova dva gena u odnosu na nivo aktivnosti bolesti. Sve se moglo na kraju svesti na indivudualne slučajeve koji se objašnjavaju individualnim genetičkim variranjem.

Ekstremna razlika ekspresije ova dva gena utvrđena je samo kod jednog slučaja. (TIMP1-19,45 naspram  MMP1- 46,47).

Jedan uzorak  imao je MMP1 ekspresiju 44,44 ali skoro nedetektabilan nivo ekspresije TIMP1 gena. Kod ovoga pacijenta ove vrijednosti su bile u korelaciji sa povećanjem nivoa CD3+/HLA-DR nakon urađene fenotipizacije. Radilo se o pacijentu sa antifosfolipidnim sindromom.

U nastavku istraživanja bi svakako bilo interesantno uključiti i molekularno-biološka istraživanja ekspresije MMP-9 gena, IL-2, IL-10 gena, IL-15 i IL-17 gena i TGF-B gena čime bi se sklopila slika o sadejstvu metaloproteinaza i njihovih inhibitora, uticaja citokina na gensku ekspresiju, a u svjetlu kvantitativnih mjerenja specifičnih SEL biomarkera aktivnosti.

Inače neki od hospitaliziranih SEL pacijenata imali su overlap sindrom i primali su odgovarajuću simptomatsku terapiju, odnosno radilo se o preklapanju simptomatologije nekoliko sistemskih oboljenje kao što su SEL, RA i Sjogrenov sindrom. Pokazalo se da su ovakvi pacijenti izuzetno dobar model  za selektivno razlučivanje kvantitativnih vrijednosti SEL biomarkera pojedinačno za svako sistemsko oboljenje. Neki od takvih pacijenata su imali antifosfolipidni sindrom.

Ključne riječi:
SLE, biomarkeri, ANA-IFA, ELISA, nefelometrija, protočna citometrija, PCR


   početna stranica
webmaster